微生物鉴定基础——革兰氏染色

历史起源

在微生物领域，有什么比革兰氏染色更广泛的应用？自从1884年发明以来，它一直在被频繁使用，而且作为一种初筛的手段与现代化的鉴定方法有了更多的结合。

它初应用是在临床环境中。当检查脓肿的脓液涂片时，革兰氏染色可以过滤掉大约一半临床相关细菌，为紧急选择使用哪一类抗生素提供指导。脊髓液的革兰氏染色可显示出革兰氏阳性球菌（可能是肺炎球菌），革兰氏阴性球菌（几乎肯定是脑膜炎球菌），革兰氏阴性杆菌（流感嗜血杆菌）

标准步骤

结晶紫初染

不管革兰氏阳性还是阴性细菌都可以被结晶紫染色

碘液媒染

革兰氏阳性菌的颜色其实是复合颜色（结晶紫+碘液）

乙醇脱色

95％乙醇，注意控制时间

番红复染

革兰氏阳性菌其实也带有番红的颜色，只是结晶紫颜色更深

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革兰氏染色的基础是不同细菌细胞壁的不同。革兰氏阳性菌通常具有厚的肽聚糖层，可以保持初染媒染的染料。而革兰氏阴性菌肽聚糖层比较薄，初染媒染的染料在乙醇脱色时逸出。所以作为关键点来说，就是细胞壁，任何影响细胞壁的事件都有可能导致革兰氏染色的错误结果。

比如菌龄（细菌的培养时间）很重要，太嫩的细胞壁还没有形成，太老的有可能又自融了。如果抑制性平板上的抑制剂刚好抑制的是细胞壁的话，那你革兰氏染色也无效。还有一些来源于血培养或者牛奶培养的细菌，细胞壁的通透性会存在不同。所以染色前的培养要点是：基础培养基上的新鲜（是指数期）纯培养产物。

革兰氏染色只是分类学上人为设计的一个方法，并不是非黑即白（应该是非紫即红）的确切判断。一些细菌在染色之后会表现为紫色和红色的混合，让人肉眼无法分辨。而且还有一些细菌在生长过程中细胞壁的肽聚糖层厚度会逐渐变薄或强度变弱，例如芽孢杆菌、丁酸弧菌和梭菌，导致生长后期会革兰氏染色结果发生改变（由阳性变成阴性）。另外还有一些细菌，例如分支杆菌、结核菌和麻风杆菌，革兰氏染色的结果不可预见。

在国外的一些研究中，科学家将经过特殊革兰氏染色的细菌进行薄切片后电子显微镜下观察。发现很多杆菌、放线菌、梭菌会在培养的不同阶段部分发生革兰氏染色结果的改变。（原始论文联系石决明个人微信micro-bob索取）

思考1革兰氏染色会从阴性变为阳性吗？

革兰氏染色不仅仅是看颜色，更全面的做法是要结合显微镜的形态进行分类鉴定。

从上表中可以看出，两列内容可以有很多种组合，将革兰氏染色的分类作用进行放大。在一些厂家的全自动生化鉴定仪的设计中，也是通过这种方式设计培养卡的（如下图所示）。

思考2革兰氏阴性球菌存在吗？

随着微生物科学的发展，革兰氏染色其实在鉴定领域已经没有多少技术优势，又存在一些不确定性。但是由于操作成本低、时间短、容易理解掌握，一直有广泛的应用基础。发展下来，反而成了其他鉴定手段的步初筛方法，比如上文提到的生化鉴定培养卡的选择（在Vitek Compact系统、Biolog系统、Phoenix系统中均是如此），还有质谱鉴定系统中基质的选择。

另外，有人在朋友圈分享过革兰氏染色的“灵异”事件。革兰氏染色阴性的球菌被基因鉴定为藤黄微球菌，与常规认识的藤黄微球菌为革兰氏阳性有出入。这可以视作为新老鉴定技术的碰撞。