怎么保证微生物检测中菌悬液不会制备化验结果的准确

一、操作步骤

  我们以平时常使用的大肠埃希氏菌为例，其它菌种操作方法类似。

  1.菌种制备：从菌种保存管中吸取适量菌液，转接到新鲜制备的TSB中，在30℃-35℃条件下培养18-24h。

  2.菌液稀释：吸取步骤1培养后的菌液1mL，加入到9mL的pH7.0氯化钠-蛋白质缓冲液中，进行1：10、1：100、1:1000等的稀释。

  3.平板计数：取稀释好的菌液，一般取3个稀释级，每个稀释级2块90mm平皿，每皿加入1mL菌液，将温度在45℃左右的TSA倾入已经加有1ml菌液的平皿中，轻轻摇匀，静置，待培养基凝固后，置30-35℃培养箱中倒置培养48h。

  4.菌落计数：在培养指定时间后，将平板从培养箱中取出进行菌落计数，以确定符合实验要求的稀释倍数。

二、注意事项

  1.菌种制备：另外也可以使用TSA平皿进行菌种的培养，如果转接的是菌种冻存管中的菌，宜再转接一次，使用第二次转接的菌种。

  2.菌液稀释：吸取菌液时，需要先对菌液进行振荡或吹打混匀。可以不用进行倍比稀释，只要能保证加入到测试样品中的菌的菌落数符合要求即可。

  3.平板计数：吸取菌液时同样需要先将试管中的菌液进行振荡或吹打混匀。

  4.培养基菌落计数：不建议每天都观察结果，因为平板中可能有凝集水， 如果每天观察拿动平板，可能会使凝集水落到菌落上，导致菌会顺着水流到空白地方，影响计数结果；另外如果是霉菌，因为霉菌有孢子，拿动平皿会导致孢子落到平板空白地方，也会影响计数结果。

三、实验思考

  1.菌液的作用

  菌悬液的储存期的要求

  《中国药典》20版和《欧洲药典》8.0版要求菌液若放置在室温，菌悬液必须在2小时内使用，若放置在2-8℃条件下保存，可以在24h内使用。

  可是菌悬液的菌的数量需要在48h后才能确定，但是在24h之内菌悬液又必须使用，所以在不知道菌含量的情况下，样品测试需要做至少三个浓度梯度。

  之前在微生物实验室做了5次的菌悬液制备，为了保证实验的成功，每次都是要做三个梯度，虽然大多数都是同一个稀释级的含量符合要求，但还是会有另一个稀释级符合要求的情况，所以实验员每次都做三个梯度的测试，日常的无菌检查和控制菌检查中没有阳性对照的要求。

  这里说的三个梯度不只是适用于计数法，而是菌悬液实际运用的测试中也需要三个梯度，举个例子，某个无菌产品无菌检查中的阳性对照测试，需要做三个对照。当然，同样的产品方法适用性，培养基的促生长能力也是同法操作，操作过程图如下：